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本制品是使用重组鼠白血病毒逆转录酶(M-MuLV RTase)，从总RNA或者Poly(A)+ RNA合成第一链cDNA的试剂盒，含有cDNA第一链合成所需的所有试剂。M-MuLV具有DNA聚合酶活性，延伸能力较强，最大限度的将RNA转录成第一链cDNA。合成的第一链cDNA可广泛应用于第二链合成、杂交、PCR扩增、Real-time PCR反应等。

• RNA样品要避免基因组DNA污染。用于cDNA合成的器具须用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液37℃浸泡12h；然后在120℃高压灭菌30min去除残留的DEPC。
  
• 用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌(180℃，60min)或者上述DEPC处理的器具盛装，使用的无菌水须用0.1% DEPC处理后进行高温高压灭菌。建议RNA实验使用的器具、试剂和无菌水专用。
  
• 不必从总RNA中分离Poly(A)+ mRNA，但以Poly(A)+ mRNA为模板可以提高终产物得率和纯度。
  
• 提高反应温度到45℃有利于解决富含GC二级结构的mRNA问题。但M-MuLV RT的热敏感性会降低cDNA合成物的产量。
  
• cDNA产物应置于-20℃保存。
  
• 在进行实验操作时应将酶放置于冰上，待实验结束后于-20℃保存。

• 在冰浴的试管中加入如下反应混合物：
  

  成分		用量
  模板	总RNA	＜5μg
  	Poly(A)+ RNA	＜1μg
  	特异性RNA	＜0.5μg
  引物	Oligo(dT)(0.5μg/μL)	1μL
  	随机六合引物(0.2μg/μL)
  	序列特异性引物(20pmol)
  RNase-free ddH2O		至12μL

• 轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴30s，然后离心3～5s。
  
• 将试管冰浴，再加入如下成分：
  

  成分	用量
  5×Reaction Buffer	4μL
  RNase Inhibitor(40U/μL)	1μL
  dNTP Mix(10mM)	2μL
  M-MuLV RT(200U/μL)	1μL

• 轻轻混匀后离心3～5 s。
  
• 在PCR仪上按下列条件进行反转录反应
  

  过程	温度	时间
  cDNA合成	42℃	30～60min
  终止反应	70℃	10min

  注：
  
  • 处理后，置于冰上放置。
    
  • 如果使用Oligo (dT)引物或序列特异性引物，进行42℃，30～60min反应；
    
  • 如果使用随机引物，应先进行25℃，10min反应，然后进行42℃，30～60min反应；
    
  • 如果RNA的模板GC含量较高，可将反转录的温度提高到45℃。